Noutăți

Testele de chemosensibilitate tumorală (TCA) și chimioterapia personalizată

în 09.11.2021

Un review publicat în iunie 2021 de revista „Medicina” a Universității Lituaniene de Științe ale Sănătății prezintă cele mai recente date din domeniul testelor de chemosensibilitate tumorală (TCA) și farmacogenetică în tratamentul cancerului. Studiul prezintă ultimele rezultate ale cercetărilor de chemorezistență și chemosensibilitate, propunând o oncologie personalizată, care să se bazeze pe evaluarea chemosensibilității tumorale a fiecărui pacient în parte.

Potrivit stuiului [1], chimioterapia reprezintă o opțiune importantă pentru tratamentul diferitelor tipuri de cancer și este inevitabilă mai ales în stadiul metastatic. În ultimii 50 de ani, au fost introduse multe medicamente chimioterapeutice, dar nu există încă o îmbunătățire satisfăcătoare a rezultatului clinic la pacienții oncologici. Aceasta, deoarece cancerul este o boală eterogenă și răspunsurile la același chimioterapeutic pot varia de la un pacient la altul, chiar dacă celulele canceroase provin din același organ (același fenotip histologic).

Pentru a depăși această dificultate, se impune ca tratamentele să fie personalizate (chimioterapie personalizată). În acest scop, cercetarea acționează în două direcții: pe de o parte, folosește testele de chemosensibilitate tumorală bazate pe biologia funcțională a tumorii pentru a determina sensibilitatea chimică a fiecărui pacient la diferitele chimioterapeutice. Pe de altă parte, sunt valorificate testele de farmacogenetică bazate pe tehnologiile genetice. Farmacogenetica se ocupă cu modul în care unele variante (polimorfisme) ale genelor afectează răspunsul organismului la anumite medicamente. La momentul actual, combinarea acestor teste pare a fi cea mai bună soluție în practica oncologică.

TCA-urile au o valoare predictivă negativă satisfăcătoare (care arată posibilitatea rezistenței la medicamente), variind de la aproximativ 66% la 95%, și o valoare predictivă moderată pozitivă (care arată posibilitatea de sensibilitate la medicament), variind de la aproximativ 50% la 85%. Pe de altă parte, farmacogenetica este, într-o oarecare măsură, capabilă să ofere câteva indicii privind posibilitatea efectelor secundare ale medicamentelor, deși nu este încă în uz clinic. Din acest motiv, combinația de TCA și farmacogenetică ar putea oferi medicilor oncologi date utile pentru gestionarea bolii. De exemplu, în timp ce TCA ar putea permite eliminarea medicamentelor ineficiente (datorită valorii predictive negative ridicate), farmacogenetica ar putea ajuta oncologii să aleagă cele mai bune opțiuni medicamentoase posibile dintre medicamentele testate prin testul TCA.

TCA-urile sunt concepute pentru a selecta cea mai potrivită opțiune de chimioterapie pentru pacienții oncologici, indicând rezistența sau sensibilitatea fiecăruia la diferitele medicamente. De-a lungul anilor, TCA-urile au înregistrat progrese satisfăcătoare, evoluând de la teste simple, din punct de vedere tehnologic (de exemplu, testul clonogenic), la teste avansate din punct de vedere tehnologic (de exemplu, testele bazate pe luminiscență, cum ar fi ATP-TCA sau organoidele). Datorită realizărilor tehnologice, chiar și sistemele microfluidice au început să fie utilizate pentru TCA-uri. De exemplu, rezultatele unui studiu efectuat cu un sistem microfluidic utilizat pentru screening-ul în timp real al medicamentelor într-un mediu 3D a indicat faptul că sistemul microfluidic detectează rezistența și sensibilitatea celulelor canceroase la chimioterapice în mai puțin de 12 ore. Mai mult, a fost creat un model matematic specific pacientului pentru a fi utilizat în efectuarea TCA-ului și permite prezicerea răspunsului clinic la un număr de până la 31 de medicamente în termen de 5 zile după biopsia măduvei osoase.

TCA-urile sunt în măsură să ghideze medicii oncologi cu privire la medicamentele anti-cancer care au mai multe șanse să funcționeze suficient de bine la un anumit pacient. Unele rapoarte au arătat că TCA-urile ar putea ajuta oncologii să prezică rata de răspuns, recurența, rezistența la medicamente pe bază de platină, supraviețuirea fără remisie a bolii, precum și rata de supraviețuire totală a pacienților cu cancer. TCA-urile au fost folosite cu succes pentru a selecta un regim de tratament mai bun la pacienții cu metastază hepatică colorectală și s-a demonstrat că tratamentul pe bază de testare a determinat răspunsuri mai bune la medicamente. Unele rapoarte din literatura de specialitate arată clar că există o corelație între rezultatele TCA-uri și rezultatele pacienților. Mai mult, s-a raportat că există o bună corelație între genele care se presupune că vor fi implicate în mecanismele de sensibilitate/rezistență la medicamente și chemosensibilitatea in vitro. Acest lucru este deosebit de important în definirea semnăturilor predictive pentru a ghida chimioterapia individualizată. Luând în considerare cele de mai sus, TCA-urile continuă să câștige interesul cercetătorilor în domeniu, după cum dovedește numărul tot mai mare de publicații care fac referire la TCA-uri în ultimii ani.

Metode TCA

1.Testul clonogenic pentru tumori umane (Human Tumor Clonogenic Assay - HTCA)

Creșterea clonală a celulelor de mamifere a fost realizată pentru prima dată în anii 1950. Ulterior, în 1977, A. W. Hamburger și S.E. Salmon [2] au realizat testul clonogenic pentru tumori umane, în virtutea capacității de creștere clonală a celulelor tumorale. Astfel, HTCA este un sistem bazat pe formarea de colonii de agar moale, conceput pentru creșterea țesuturilor tumorale, care permite predicții ale răspunsurilor la chimioterapie pentru pacienții oncologici. HTCA a fost inițial considerat un instrument util pentru evaluarea efectelor antitumorale in vitro ale medicamentelor. Cu toate acestea, așa cum s-a menționat mai sus, metoda a fost utilizată pentru a determina răspunsul la medicament (sensibilitate/rezistență) în special în anii 1980. Cu timpul însă, specialiștii și-au pierdut interesul pentru acest tip de test, deoarece consumă mult timp, este subiectiv și nu este potrivit pentru automatizare. Din aceste motive, pare să nu mai fie util în predicția răspunsului pacienților oncologici la chimioterapie, însă are încă o valoare semnificativă în activitățile de cercetare bazate pe celulele stem.

2.Testele MTT de chemosensibilitate

Testul MTT este un test colorimetric simplu și rapid, de viabilitate celulară, pentru stabilirea activității metabolice a celulelor. Principiul testului este reducerea sării de tetrazoliu MTT la un cristal formazan albastru/violet de către celulele vii, dar nu și de către celulele moarte. Poate fi, de asemenea, utilizat pentru a măsura chemosensibilitatea celulelor tumorale. Testele de chemosensibilitate bazate pe MTT au fost evaluate în mai multe tipuri de cancer, cum ar fi leucemia la copii, cancerul cerebral, colorectal, leucemia mieloidă acută, cancerul pulmonar și ovarian.

Cu toate acestea, testul MTT are unele dezavantaje. De exemplu, mitocondriile deteriorate sau inactivate pot produce cristale de formazan, unele substanțe chimice pot interacționa cu sarea MTT, rezultând rezultate false, sau agenții testați pot interfera cu activitatea dehidrogenazei mitocondriale, conducând la activarea sau inhibarea dehidrogenazelor mitocondriale. În felul acesta, se ajunge la supra- sau subestimarea rezultatelor testului MTT. Prin urmare, orice date de chimiosensibilitate/chimiorezistență tumorală din literatura de specialitate obținute prin testul MTT ar trebui interpretate cu mare prudență pentru a evita rezultatele fals pozitive/negative.

3.Testul de bioluminiscență ATP

Moleculele de adenozintrifosfat (ATP) acționează ca surse de energie cu sisteme biologice și pot fi regăsite în toate celulele active metabolic [3]. După moartea celulei, starea de sinteză a celulei ATP dispare, iar ATP-urile endogene realizează o degradare rapidă a ATP. Din acest motiv, conținutul ATP intracelular a fost descris ca principalul indicator al viabilității celulare și devine una dintre metodele de determinare a viabilității. Testul de bioluminescență ATP a fost definit ca metoda cea mai rapidă, mai sensibilă și mai simplă dintre testele de viabilitate [4].

Testul ATP a fost dezvoltat pentru prima dată de Lundin și colegii săi ca test de viabilitate a celulelor somatice. ATP-TCA este un sistem standardizat ce poate fi adaptat la o varietate de utilizări, atât legat de liniile celulare, cât și de culturile de celule primare. În general, testele de chemosensibilitate/chemorezistență tumorală utilizează cultura celulelor tumorale in vitro, dar această metodă poate provoca contaminarea celulelor stromale în proba testată. Răspunsul celulelor stromale/epiteliale la chimioterapie poate diferi foarte mult, astfel încât contaminarea celulelor stromale poate conduce la un tratament nereușit, ca urmare a rezultatelor greșit interpretate. Din acest motiv, în această metodă sunt utilizate un mediu de cultură fără ser și plăci de polipropilenă pentru a preveni creșterea celulelor non-neoplazice pe o perioadă de incubație de 6 zile. Apoi, ATP-ul intracelular este extras printr-o soluție de liză pe bază de detergent. În felul acesta, nivelurile relative de ATP sunt măsurate prin intermediul reacției luciferină-luciferază.

Testele de chemosensibilitate bazate pe ATP au fost evaluate pe multe tipuri de tumori, cum ar fi cancerul pancreatic, cancerul ovarian, colorectal, mamar, cancerul pulmonar fără celule mici (non-small cell lung cancer). Multe studii au dovedit fiabilitatea ATP ca metodă eficientă de determinare a viabilității celulare pentru diferite linii celulare, dovedindu-se util mai ales în cancerul ovarian. Într-un studiu [5] efectuat cu celule de carcinom ovarian, s-a raportat că ATP-TCA a măsurat rezistența la cisplatină cu o precizie mai mare de 90%. Autorii au sugerat că testul de chemosensibilitate/chimiorezistență bazat pe ATP are o sensibilitate, liniaritate și precizie ridicate pentru măsurarea activității agenților particulari, dar și a combinațiilor de medicamente.

Într-un alt studiu [6], a fost raportată o corelație semnificativă între sensibilitatea/rezistența la medicament și răspunsul clinic (p = 0,007). În același studiu, testul a demonstrat o sensibilitate, specificitate, valoare predictivă pozitivă (Positive Predictive Value - PPV) și valoare predictivă negativă (Negative Predictive Value - NPV) de 95%, 44%, 66% și, respectiv, 89%. Valoarea predictivă negtivă din acest studiu este deosebit de remarcabilă, deoarece oferă o prognoză a pacienților care vor prezenta recurență (datorită rezistenței la medicamente) în termen de 12 luni de la perioada post-chimioterapie. Într-un studiu recent [7], s-a constatat că sensibilitatea, specificitatea, valoarea predictivă pozitivă și valoarea predictivă negativă pentru sensibilitatea clinică la chimioterapie au fost de 88,6%, 77,8%, 83% și 84,8% la pacienții cu cancer ovarian. Aceste valori ar trebui considerate acceptabile și promițătoare pentru viitorul testului ATP. Celălalt studiu [8] efectuat pe pacienți cu cancer pulmonar fără celule mici nerezecabil a arătat că există o corelație strânsă între rezultatele ATP-TCA și rezultatele clinice ale pacienților. Un alt studiu [9] a analizat corelațiile dintre rezultatele clinice ale pacienților și testul de chemosensibilitate tumorală la pacienții cu cancer pulmonar în stadiul III. Rezultatele au indicat faptul că ratele de supraviețuire fără remisie au fost detectate mai mult la pacienții cu o mai mare sensibilitate la medicamente, comparativ cu pacienții care prezintă rezistență la medicamente (18 vs. 8,5 luni, p <0,05).

ATP-TCA a fost studiat într-o manieră mai avansată în melanomul malign. Într-un studiu realizat de Ugurel și colab. [10] privind melanomul malign, au fost comparate valorile indicelui de sensibilitate la pacienții tratați cu Dacarbazină cu cele ale pacienților tratați cu chimioterapie clasică (cisplatină, paclitaxel, treosulfan, gemcitabină). Ei au descoperit că pacienții tratați cu chimioterapie clasică au dezvoltat efecte secundare mai severe în comparație cu cei care au urmat protocolul pe bază de Dacarbazină.

În concluzie, ATP-TCA pare să ofere corelații retrospective promițătoare ex vivo/in vivo cu valori predictive pozitive și negative acceptabile. De asemenea, ATP-TCA oferă o abordare rațională pentru evaluarea preclinică a noilor regimuri de combinație activă pentru diverse boli maligne. Mai important, chimioterapia dirijată cu ATP-TCA poate produce rate de răspuns impresionante, deși rezultatele pe termen lung (rata de supraviețuire fără remisie și supraviețuire totală) pot suferi, din lipsa unor rezultate satisfăcătoare. De asemenea, ghidarea chimioterapiei prin testele ATP pare a fi extrem de importantă la pacienții rezistenți la platină. Cu toate acestea, sunt necesare încă mai multe studii clinice pentru concluzii certe, deși corelațiile dintre rezultatele testului și răspunsul la tratament sunt foarte promițătoare. ATP-TCA este o metodologie larg acceptată și promițătoare, deoarece oferă date fiabile, chiar și în cazurile de cancer hematologic. Într-un studiu [11], s-a raportat recent că ATP-TCA a demonstrat o corelație semnificativă cu răspunsul complet la chimioterapie și ar putea fi un instrument util pentru optimizarea tratamentelor personalizate pentru pacienții cu leucemii mieloide acute.

ATP-TCA este în măsură să anticipeze nu numai cel mai bun regim de chimioterapie pentru un anumit pacient, ci și rata de supraviețuire. În consecință, într-un studiu recent, s-a arătat că pacienții cu sensibilitate mai mare la medicamente tindeau să aibă o supraviețuire mai lungă fără remisie (18 vs. 8,5 luni), decât pacienții cu rezistență la medicamente. Per ansamblu, ATP-TCA ar putea fi considerată o metodologie utilă în ceea ce privește obținerea unor rezultate mai bune ale terapiei la pacienții oncologici.

În afară de metodele menționate, autorii revizuirii menționează și alte tehnici de testare a rezistenței și/sau sensibilității la medicamente, cum ar fi testul de rezistență extremă la medicamente (EDR-Test)/rezistența la chimioterapie (CTR-Test) [12], testul explantului tisular [13], testul de citotoxicitate diferențială cu săruri de tetrazoliu [14], testul fluorescent cytoprint (FCA) [15], testul de sensibilitate la medicamente pe bază de cultură încorporată în gel de colagen [16].

În prezent, sunt disponibile numeroase studii clinice care examinează corelația dintre răspunsul tumorii in vitro și rezultatele clinice. Aceste date sugerează că testele de răspuns la medicamente in vitro pot prognoza cu precizie rezistența la medicamente și pot identifica pacienții care sunt mai mult sau mai puțin susceptibili de a beneficia de un anumit medicament. Aceste rezultate extrem de promițătoare fac posibilă proiectarea unor tratamente adaptate pentru fiecare pacient în parte.

În final, autorii arată că personalizarea chimioterapiei în cancer este inevitabilă, dat fiind că există la ora actuală p multitudine de medicamente chimioterapeutice. Pentru medicii oncologi este esențial să știe care chimioterapeutic este eficient pentru fiecare pacient în parte. În acest sens, testele de chemosensibilitate pot avea o importanță vitală în stabilirea tratamentului optim.

[1] https://doi.org/10.3390/medicina57060636

[2] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/560061/

[3] https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/002217599390011U

[4] Lomakina, G.Y., Modestova, Y.A. & Ugarova, N.N. Bioluminescence assay for cell viability. Biochemistry Moscow 80, 701–713 (2015). https://doi.org/10.1134/S0006297915060061. Riss J, Khanna C, Koo S, Chandramouli GV, Yang HH, Hu Y, Kleiner DE, Rosenwald A, Schaefer CF, Ben-Sasson SA, Yang L, Powell J, Kane DW, Star RA, Aprelikova O, Bauer K, Vasselli JR, Maranchie JK, Kohn KW, Buetow KH, Linehan WM, Weinstein JN, Lee MP, Klausner RD, Barrett JC. Cancers as wounds that do not heal: differences and similarities between renal regeneration/repair and renal cell carcinoma. Cancer Res. 2006 Jul 15;66(14):7216-24. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-0040. PMID: 16849569.

[5] Andreotti, P.; Cree, I.; Kurbacher, C.M.; Hartmann, D.M.; Linder, D.; Harel, G.; Gleiberman, I.; Caruso, P.; Ricks, S.H.; Untch, M. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: Clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 1995, 55, 5276–5282.

[6] Konecny, G.; Crohns, C.; Pegram, M.; Felber, M.; Lude, S.; Kurbacher, C.; Cree, I.A.; Hepp, H.; Untch, M. Correlation of drug response with the ATP tumorchemosensitivity assay in primary FIGO stage III ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 2000, 77, 258–263.

[7] Zhang, J.; Li, H. Heterogeneity of tumor chemosensitivity in ovarian epithelial cancer revealed using the adenosine triphosphatetumor chemosensitivity assay. Oncol. Lett. 2015, 9, 2374–2380.

[8] Moon, Y.W.; Choi, S.H.; Kim, Y.T.; Sohn, J.H.; Chang, J.; Kim, S.K.; Park,M.S.; Chung, K.Y.; Lee, H.J.; Kim, J.H. Adenosine triphosphatebased chemotherapy response assay (ATP-CRA)-guided platinum-based 2-drug chemotherapy for unresectable nonsmall-cell lung cancer. Cancer 2007, 109, 1829–1835.]

[9] Chen, Z.; Zhang, S.; Ma, S.; Li, C.; Xu, C.; Shen, Y.; Zhao, J.; Miao, L. Evaluation of the in vitro Chemosensitivity and Correlation with Clinical Outcomes in Lung Cancer using the ATP-TCA. Anti Cancer Agents Med. Chem. 2018, 18, 139–145.]

[10] Ugurel, S.; Loquai, C.; Terheyden, P.; Schadendorf, D.; Richtig, E.; Utikal, J.; Gutzmer, R.; Rass, K.; Sunderkötter, C.; Stein, A.; et al. Chemosensitivity-directed therapy compared to dacarbazine in chemo-naive advanced metastatic melanoma: A multicenter randomized phase-3 DeCOG trial. Oncotarget 2017, 8, 76029–76043.

[11] Xia, F.; Ma, S.; Bian, Y.; Yu, D.; Ma, W.; Miao, M.; Huang, C.; Miao, L. A retrospective study of the correlation of in vitro chemosensitivity using ATP-TCA with patient clinical outcomes in acute myeloid leukemia. Cancer Chemother. Pharmacol. 2019, 85, 509–515.

[12] Eltabbakh, G.H. Extreme drug resistance assay and response to chemotherapy in patients with primary peritoneal carcinoma. J. Surg. Oncol. 2000, 73, 148–152. Eltabbakh, G.H.; Piver, M.S.; Hempling, R.E.; Recio, F.O.; Lele, S.B.; Marchetti, D.L.; Baker, T.R.; Blumenson, L.E. Correlation between extreme drug resistance assay and response to primary paclitaxel and cisplatin in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 1998, 70, 392–397. Holloway, R.W.; Mehta, R.S.; Finkler, N.J.; Li, K.T.; McLaren, C.E.; Parker, R.J.; Fruehauf, J.P. Association between in vitro platinum resistance in the EDR assay and clinical outcomes for ovarian cancer patients. Gynecol. Oncol. 2002, 87, 8–16.

[13] Brower, S.L.; Fensterer, J.E.; Bush, J.E. The ChemoFx assay: An ex vivo chemosensitivity and resistance assay for predicting patient response to cancer chemotherapy. Methods Mol. Biol. 2008, 414, 57–78. [PubMed], Suchy, S.L.; Landreneau, R.J.; Schuchert, M.J.;Wang, D.; Ervin, P.R., Jr.; Brower, S.L. Adaptation of a chemosensitivity assay to accurately assess pemetrexed in ex vivo cultures of lung cancer. Cancer Biol. Ther. 2013, 14, 39–44.

[14] Alley, M.C.; Scudiero, D.A.; Monks, P.A.; Hursey, M.L.; Czerwinski, M.J.; Fine, D.L.; Abbott, B.J.; Mayo, J.G.; Shoemaker, R.H.B.; Boyd, M.R. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res. 1998, 48, 589–601. Weisenthal, L.M. Differential staining cytotoxicity assay: A review. Cancer Cell Cult. 2011, 731, 259–283.Bird, M.C.; Bosanquet, A.G.; Forskitt, S.; Gilby, E.D. Semi-micro adaptation of a 4-day differential staining cytotoxicity (DiSC) assay for determining the in-vitro chemosensitivity of haematological malignancies. Leuk. Res. 1986, 10, 445–449.

[15] Meitner, P.A. The fluorescent cytoprint assay: A new approach to in vitro chemosensitivity testing. Oncology 1991, 5, 75–81. Leone, L.A.; Meitner, P.A.; Myers, T.J.; Grace,W.R.; Gajewski,W.H.; Fingert, H.J.; Rotman, B. Predictive value of the fluorescent cytoprint assay (FCA): A retrospective correlation study of in vitro chemosensitivity and individual responses to chemotherapy. Cancer Investig. 1991, 9, 491–503.

[16] Goto, H.; Kitagawa, N.; Sekiguchi, H.; Miyagi, Y.; Keino, D.; Sugiyama, M.; Sarashina, T.; Miyagawa, N.; Yokosuka, T.; Hamanoue, S.; et al. The Collagen Gel Droplet–embedded Culture Drug Sensitivity Test in Relapsed Hepatoblastoma. J. Pediatr. Hematol. 2017, 39, 395–401. Kobayashi, H.; Tanisaka, K.; Doi, O.; Kodama, K.; Higashiyama, M.; Nakagawa, H.; Miyake, M.; Taki, T.; Hara, S.; Yasutomi, M.; et al. An in vitro chemosensitivity test for solid human tumors using collagen gel droplet embedded cultures. Int. J. Oncol. 1997, 11, 449–455. Takamura, Y.; Kobayashi, H.; Taguchi, T.; Motomura, K.; Inaji, H.; Noguchi, S. Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers. Int. J. Cancer 2002, 98, 450–455.